Elisa

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most widely used immunoassay today. The method is an experimental method (several ng/mL) that can qualitatively and quantitatively quantify Ag or Ab by utilizing Ag-Ab interaction. This method confirms the antigen-antibody reaction by binding an enzyme to an antibody. It is simple, inexpensive, and allows for large-scale analysis, making it one of the most widely used antigen-antibody analysis methods today.

It was simultaneously developed by two groups in France (Avrameas and Guilbert, 1971) and Sweden (Engvall and Perlman, 1971) in the early 1970s. As the name ELISA suggests, this method uses enzymes. The concentration of the antigen is determined by the degree of substrate conversion. In addition, the name ELISA implies that the principle of antibodies or antigens being adsorbed to a solid phase (immunosorbent) is included. Adsorption on the solid phase allows free antigens that are not bound to be removed through washing. This method is an experiment to confirm whether the antibody we want (i.e., specific to the antigen used for immunization) is produced in the serum obtained after immunizing a mouse or rabbit, or in the culture supernatant of a hybridoma obtained through fusion. In particular, this method is a method that is increasingly being used because it is a very sensitive reaction like the radioimmunoassay (RIA) but has the advantage of not using radioactivity like RIA.

Although various immunoassay methods are being developed, sandwich and competitive ELISA methods are most frequently used. In most cases, sandwich ELISA has high sensitivity. Direct ELISA is also used, in which antigens, not antibodies, are fixed to a solid phase. Direct ELISA is used to detect antigen-specific antibodies present in patient serum or hybridoma culture supernatant.

Among the enzymes that bind to antibodies, a color reaction is used when a simple substrate solution is added. Representative enzymes include alkaline phosphatase and horseradish peroxidase (HRP). These enzymes are used by covalently binding to the Fc region of the antibody molecule through a chemical reaction.


Types of ELISA

1) Direct ELISA (Direct quantitative method)
The direct method refers to a method that uses an enzyme directly conjugated to an antibody that reacts with an antigen.

a) Measures the amount of antigen, b) Requires a labeled antibody for the antibody, c) Requires an antigen

2) Indirect ELISA
An analysis method in which the antibody that binds to the antigen (primary antibody) does not have an enzyme, and the antibody that binds to that antibody (secondary antibody) has an enzyme conjugated to it. It is generally sold in the form of an enzyme conjugated to an antibody for an isotype (enzyme conjugated anti-isotype antibody, for example, alkaline phosphatase conjugated anti-mouse IgG, etc.), and you can purchase and use an enzyme-conjugated antibody that matches the isotype of the primary antibody you are using.

3) Sandwich ELISA (Sandwich quantitative method); Used for quantitative and qualitative determination of antigens

This method involves first binding an antibody to the plate so that the antigen binds well to the plate, binding the antigen to the antibody, and then examining it using a direct or indirect method. It is used when the amount of antigen is small or when examining an antigen in an unknown sample.

a) Measures the amount of antigen, b) Requires two antigen-specific antibodies, c) Not suitable for hapten detection,
d) High sensitivity

4) Competitive ELISA (Competitive quantitative method); Used for quantitative and qualitative determination of antibodies

Competitive quantitative method is performed by competition between two antigens for the same binding site of the antibody. One of the two antigens is labeled with an isotope or enzyme, and the other is unlabeled. Competitive quantitation requires the preparation of a labeled antigen, an unlabeled antigen to create a standard curve (the antigen to be quantified), a monoclonal antibody (or antiserum) that specifically binds to the antigen, and a sample containing the antigen. The principle is that a weak labeled signal is detected from the reaction complex according to the reaction of the unlabeled antigen and antibody contained in the sample, and the antigen contained in the unknown sample can be quantified by the standard curve. According to the competitive principle, the free binding site of the antibody becomes a ‘limiting factor’ in the reaction solution.

a) Measuring the amount of antigen, b) Requires labeled antigen, c) Requires antigen-specific antibodies, d) Suitable for hapten detection.

Coating, blocking, washing

1) Coating

The first step of ELISA is the process called 'coating', which binds antibodies or antigens to a solid phase. Usually, a 96-well microtiter plate is used as a solid phase material. Adsorption of antibodies or antigens is a common coating method. Microtiter plates made of polystyrene are particularly good at binding proteins. This protein binding is hydrophobic and in most cases, PBS (pH 7.4) or sodium carbonate buffer (pH 9.6) is used as a solvent.

Milk powder dissolves well in warm PBS.

The experimenter must determine the coating buffer solution to be used for the stability of the antibody or antigen. Also, the concentration of the appropriate antibody or antigen to be coated for the analysis must be experimentally determined within the range of 0.5-10.0 ㎍/㎖. Using a higher concentration may result in the formation of unstable double or multiple antibody or antigen layers, which may be counterproductive. Coating is generally performed by adding 50-200 ㎕ of coating buffer solution containing the antibody or antigen to each well of a 96-well plate and reacting overnight (10-18 hours) at 2-8℃. In order to avoid the loss of the antigen-antibody complex during multiple washing steps during the experiment, there is also a method of covalently binding the antibody or antigen to a polystyrene microtiter plate activated by a photochemical reaction and coating it. This method has the advantage of saving time because it can be coated in 45 minutes in a carbonate-bicarbonate buffer solution (pH 9.6).



2) Blocking

Background activity generated by nonspecifically adsorbed enzyme-labeled antibodies or antigen molecules causes problems in ELISA quantitation. Therefore, blocking of free protein binding sites is an essential step to minimize background activity. BSA, FCS, casein, gelatin, etc. are used for blocking. Among them, milk powder, which is commonly available in supermarkets, is an economical method. 10 mM PBS - 0.5-5% BSA is often used as a traditional blocking reagent. Adding nonionic detergents such as Tween 20, Nonidet P-40, and Triton X-100 at a concentration of 0.01-0.1% during reaction with labeled antibodies or antigens can reduce nonspecific adsorption to the solid phase without interfering with specific antigen-antibody binding.

3) Washing
Washing between each reaction step is essential to obtain a good standard curve and satisfactory ELISA results. PBS, saline, PBS-detergent, tap water, etc. can be used in the washing step. A common washing buffer is PBS/0.05% Tween 20.

Enzyme and substrate

Enzymes used in ELISA include horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) extracted from horseradish, β-galactosidase extracted from Escherichia coli, and glucose oxidase extracted from Aspergillus niger.

(c); chromogenic substrate, (f); fluorimetric-detectable substrate, ABTS; 2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-6-sultanate, HPPA; 3-(p-hydroxyphenyl) propionic acid, MUG; 4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside, MUP; 4-methylumbelliferyl phosphate, oNPG; o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, oPD; o-phenylenediamine, pNPP; p-nitrophenyl phosphate, TMB; 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine.


Enzyme activity can be detected by colorimetric, fluorescent, or luminometric substrates. Colorimetric substrates are widely used and have the following advantages: ① The colored final product can remain stable for a long time even after the reaction is stopped. ② The microtiter plate can be quickly and visually detected during the selection process. ③ The product can be measured quickly with a relatively inexpensive photometer. The sensitivity can be increased by about 2-10 times when measuring with fluorescent or luminometric substrates, but the measuring equipment is expensive and the final reactant disappears quickly. However, when the sample that can be measured is limited, the use of fluorescent-detectable substrates is useful because it reduces the starting solution volume for detection. Table 2-2 shows the enzymes and substrates used in ELISA. If sensitivity is particularly important for the quantitative method, the enzyme is HRP.